page_banner

ข่าว

เทคนิคและการประยุกต์ใช้หลักการ Pcr เชิงปริมาณเรืองแสงแบบเรียลไทม์

PCR เชิงปริมาณการเรืองแสงแบบเรียลไทม์เป็นวิธีการวัดปริมาณรวมของผลิตภัณฑ์หลังจากแต่ละรอบปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ในปฏิกิริยาการขยายดีเอ็นเอโดยใช้ฟลูออโรฟอร์วิธีการนี้ใช้ในการหาปริมาณลำดับดีเอ็นเอเฉพาะในตัวอย่างเพื่อทดสอบโดยวิธีการอ้างอิงภายในหรือภายนอกนับตั้งแต่เริ่มก่อตั้ง การทดสอบ PCR เชิงปริมาณด้วยฟลูออเรสเซนต์ได้รับความนิยมเพิ่มขึ้นในหมู่ครูในห้องปฏิบัติการ

หลักการ Fluorescence PCR: Fluorescence PCR ครั้งแรกเรียกว่า TaqManPCR และต่อมาเรียกว่า Real-TimePCR เป็นเทคนิคการหาปริมาณกรดนิวคลีอิกแบบใหม่ที่พัฒนาโดย PE (PerkinElmer) ในสหรัฐอเมริกาในปี 1995 เทคนิคนี้ใช้โพรบที่ติดฉลากเรืองแสงหรือที่สอดคล้องกัน สีย้อมเรืองแสงสำหรับ PCR ทั่วไปเพื่อให้ได้ฟังก์ชันเชิงปริมาณหลักการ: เมื่อปฏิกิริยา PCR ดำเนินต่อไป ผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยา PCR จะสะสมและความเข้มของสัญญาณเรืองแสงจะเพิ่มขึ้นในสัดส่วนที่เท่ากันในแต่ละรอบ สัญญาณความเข้มของการเรืองแสงจะถูกรวบรวม เพื่อให้เราสามารถติดตามการเปลี่ยนแปลงของปริมาณผลิตภัณฑ์โดยการเปลี่ยนแปลงของความเข้มของการเรืองแสง และทำให้ได้กราฟเส้นโค้งการขยายการเรืองแสง

เรืองแสงแบบเรียลไทม์3
เรืองแสงแบบเรียลไทม์2

โดยทั่วไป เส้นโค้งการขยายสัญญาณเรืองแสงสามารถแบ่งออกเป็นสามขั้นตอน: เฟสสัญญาณพื้นหลังเรืองแสง เฟสการขยายสัญญาณแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลของสัญญาณเรืองแสง และเฟสที่ราบสูงระหว่างเฟสสัญญาณพื้นหลัง สัญญาณเรืองแสงที่ขยายแล้วจะถูกปิดบังโดยสัญญาณพื้นหลังเรืองแสง และไม่สามารถระบุการเปลี่ยนแปลงในจำนวนผลิตภัณฑ์ได้ในช่วงที่ราบสูง ผลิตภัณฑ์การขยายเสียงจะไม่เพิ่มขึ้นแบบทวีคูณอีกต่อไป ไม่มีความสัมพันธ์เชิงเส้นตรงระหว่างจำนวนผลิตภัณฑ์สุดท้ายกับจำนวนเทมเพลตเริ่มต้น และหมายเลขสำเนา DNA เริ่มต้นไม่สามารถคำนวณตามจำนวนผลิตภัณฑ์ PCR สุดท้ายได้เฉพาะในระยะการขยายแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์เท่านั้นที่มีความสัมพันธ์เชิงเส้นตรงระหว่างลอการิทึมของจำนวนผลิตภัณฑ์ PCR และจำนวนเทมเพลตเริ่มต้น และเราสามารถเลือกหาปริมาณได้ในขั้นตอนนี้เพื่อความสะดวกในการหาปริมาณและการเปรียบเทียบ แนวคิดที่สำคัญมากสองประการได้ถูกนำมาใช้ในเทคนิค PCR เชิงปริมาณเรืองแสงแบบเรียลไทม์ ได้แก่ เกณฑ์การเรืองแสงและค่า CT

ค่าธรณีประตูคือค่าที่ตั้งไว้เทียมบนเส้นขยายสัญญาณเรืองแสงเฟสเลขชี้กำลังของการขยาย PCR

ค่า Ct: คือจำนวนรอบที่สัญญาณเรืองแสงในหลอดปฏิกิริยาแต่ละหลอดได้รับไปถึงค่าโดเมนที่ตั้งไว้

ความสัมพันธ์ระหว่างค่า Ct กับแม่แบบเริ่มต้น: การศึกษาพบว่าค่า Ct ของแต่ละแม่แบบมีความสัมพันธ์เชิงเส้นกับลอการิทึมของหมายเลขสำเนาเริ่มต้นของแม่แบบนั้น ยิ่งสำเนาของหมายเลขเริ่มต้นสำเนาจำนวนมากเท่าใด Ct ก็ยิ่งเล็กลง ค่า.ค่า Ct ค่อนข้างคงที่เส้นโค้งมาตรฐานสามารถทำได้โดยใช้มาตรฐานที่มีหมายเลขสำเนาเริ่มต้นที่ทราบ โดยพิกัดแนวนอนแสดงลอการิทึมของหมายเลขสำเนาเริ่มต้น และพิกัดแนวตั้งแทนค่า Ct ดังแสดงในรูปด้านล่าง

ดังนั้น โดยการหาค่า Ct ของตัวอย่างที่ไม่รู้จัก จำนวนสำเนาเริ่มต้นของตัวอย่างนั้นสามารถคำนวณได้จากเส้นโค้งมาตรฐาน

ค่า Ct ไม่คงที่และสามารถได้รับอิทธิพลจากตัวอย่างและเครื่องมือที่แตกต่างกัน แม้ว่าตัวอย่างเดียวกันจะทำซ้ำ 2 ครั้งในเครื่องมือเดียวกัน ค่า Ct ก็สามารถเปลี่ยนแปลงได้

การทดสอบการเรืองแสงเชิงปริมาณ: การทดสอบการเรืองแสงเชิงปริมาณสามารถแบ่งออกเป็นโพรบเรืองแสงและสีย้อมเรืองแสงขึ้นอยู่กับเครื่องหมายที่ใช้โพรบเรืองแสงประกอบด้วยเทคโนโลยีบีคอน (เทคโนโลยีโมเลกุลบีคอน แสดงโดย American Tagyi), โพรบ TaqMan (แสดงโดย ABI) และเทคโนโลยี FRET (แสดงโดยโรช);สีย้อมเรืองแสงประกอบด้วยสีย้อมเรืองแสงอิ่มตัวและสีย้อมเรืองแสงที่ไม่อิ่มตัว ตัวแทนทั่วไปของสีย้อมเรืองแสงที่ไม่อิ่มตัวคือ SYBRGreen I ซึ่งใช้กันทั่วไปในขณะนี้อิ่มตัว ตัวแทนทั่วไปของสีย้อมเรืองแสงที่ไม่อิ่มตัวคือ SYBRGreenⅠ;สีย้อมเรืองแสงอิ่มตัว ได้แก่ EvaGreen, LCGreen เป็นต้น

SYBRGreenI เป็นสีย้อมติด DNA ที่ใช้กันทั่วไปสำหรับ PCR เรืองแสง ซึ่งจับกับ DNA ที่มีเกลียวคู่โดยไม่จำเพาะเจาะจงในสภาวะอิสระ SYBRGreenI จะปล่อยแสงฟลูออเรสเซนส์แบบอ่อน แต่เมื่อจับกับ DNA แบบสองสายแล้ว การเรืองแสงของมันก็จะเพิ่มขึ้น 1,000 เท่าดังนั้น สัญญาณเรืองแสงทั้งหมดที่ปล่อยออกมาจากปฏิกิริยาจะเป็นสัดส่วนกับปริมาณของ DNA ที่มีเกลียวคู่ที่มีอยู่และเพิ่มขึ้นเมื่อผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณเพิ่มขึ้น

ข้อดีของสีย้อมติด DNA แบบสองสาย: การออกแบบทดลองอย่างง่าย ต้องการไพรเมอร์ 2 ตัวเท่านั้น ไม่จำเป็นต้องออกแบบโพรบ ไม่จำเป็นต้องออกแบบโพรบหลายตัวสำหรับการทดสอบยีนหลายตัวอย่างรวดเร็ว ความสามารถในการวิเคราะห์เส้นโค้งจุดหลอมเหลว ทดสอบความจำเพาะของ ปฏิกิริยาการขยายเสียง ต้นทุนเริ่มต้นต่ำ ลักษณะทั่วไปที่ดีและดังนั้นจึงมักใช้ในการวิจัยทั้งในและต่างประเทศ

วิธีโพรบฟลูออเรสเซนต์ (เทคนิค Taqman): เมื่อมีการขยาย PCR ไพรเมอร์คู่หนึ่งจะถูกเพิ่มพร้อมกับโพรบฟลูออเรสเซนต์เฉพาะเมื่อโพรบไม่เสียหาย สัญญาณเรืองแสงที่ปล่อยออกมาจากกลุ่มผู้รายงานจะถูกดูดกลืนโดยกลุ่มที่ดับและไม่ถูกตรวจพบโดยเครื่องมือ PCRในระหว่างการขยาย PCR (ในระยะส่วนขยาย) กิจกรรมการแตกแยก 5'-3' ของเอนไซม์ Taq จะย่อยสลายโพรบด้วยเอนไซม์ ทำให้กลุ่มสารเรืองแสงของรายงานและกลุ่มเรืองแสงดับ

การประยุกต์ใช้ PCR เชิงปริมาณเรืองแสง

การวิจัยทางอณูชีววิทยา:

1. การวิเคราะห์กรดนิวคลีอิกเชิงปริมาณการวิเคราะห์เชิงปริมาณและเชิงคุณภาพของโรคติดเชื้อ การตรวจหาจุลินทรีย์หรือไวรัสที่ทำให้เกิดโรค เช่น การระบาดล่าสุดของไข้หวัดใหญ่ A (H1N1) การตรวจหาหมายเลขสำเนายีนของพืชและสัตว์ดัดแปรพันธุกรรม การตรวจหาอัตราการยับยั้งยีน RNAi เป็นต้น

2. การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างการเปรียบเทียบความแตกต่างของการแสดงออกของยีนระหว่างตัวอย่างที่ได้รับการรักษา (เช่น การรักษาด้วยยา การรักษาทางกายภาพ การบำบัดทางเคมี เป็นต้น) ความแตกต่างในการแสดงออกของยีนที่จำเพาะในระยะต่างๆ และการยืนยันของ microarray cDNA หรือผลการแสดงออกของดิฟเฟอเรนเชียล

3. การตรวจจับ SNPการตรวจหา single nucleotide polymorphisms มีความสำคัญสำหรับการศึกษาความอ่อนไหวต่อโรคต่างๆ หรือการตอบสนองของแต่ละบุคคลต่อยาเฉพาะ และเนื่องจากโครงสร้างที่แยบยลของโมเลกุลบีคอน เมื่อทราบข้อมูลลำดับของ SNP แล้ว จึงเป็นเรื่องง่ายและแม่นยำ ใช้เทคนิคนี้สำหรับการตรวจจับ SNP ที่มีปริมาณงานสูง

4. การตรวจจับเมทิลเลชั่นเมทิลเลชั่นมีความเกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ ของมนุษย์ โดยเฉพาะมะเร็ง และ Laird ได้รายงานเทคนิคที่เรียกว่า Methylight ซึ่งปฏิบัติต่อ DNA ก่อนการขยาย เพื่อให้ไซโตซีนที่ไม่เป็นเมทิลกลายเป็นยูราซิลและไซโตซีนที่มีเมทิลเลตจะไม่ได้รับผลกระทบ โดยใช้ไพรเมอร์เฉพาะและโพรบ Taqman เพื่อแยกความแตกต่างระหว่าง DNA ที่มีเมทิลกับไม่มีเมทิล .มีความละเอียดอ่อนมากขึ้น

การวิจัยทางการแพทย์:

1. การวินิจฉัยก่อนคลอด: ผู้คนไม่สามารถรักษาโรคทางพันธุกรรมที่เกิดจากสารพันธุกรรมที่เปลี่ยนแปลงได้ และจนถึงขณะนี้ พวกเขาสามารถเพียงลดจำนวนทารกที่ป่วยที่เกิดจากการตรวจติดตามก่อนคลอดเพื่อป้องกันการเกิดโรคทางพันธุกรรมต่างๆนี่เป็นวิธีการที่ไม่รุกรานซึ่งสตรีมีครรภ์ยอมรับได้ง่าย

2. การตรวจหาเชื้อโรค: การทดสอบ PCR เชิงปริมาณเรืองแสงช่วยให้สามารถระบุปริมาณของเชื้อโรคได้ เช่น gonococcus, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, ไวรัส human papilloma, ไวรัสเริม, ไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์, ไวรัสตับอักเสบ, ไวรัสไข้หวัดใหญ่, Mycobacterium tuberculosis, EBVloloมีข้อดีคือมีความไวสูง ขนาดตัวอย่างต่ำ ความรวดเร็วและความเรียบง่ายเมื่อเทียบกับวิธีการทดสอบแบบเดิม

3. การประเมินประสิทธิภาพของยา: การวิเคราะห์เชิงปริมาณของไวรัสตับอักเสบบี (HBV) และไวรัสตับอักเสบซี (HCV) แสดงให้เห็นว่าความสัมพันธ์ระหว่างปริมาณไวรัสและประสิทธิภาพของยาบางชนิดหากระดับ HBV-DNA ในซีรัมลดลงระหว่างการรักษาด้วยลามิวูดีน และเพิ่มขึ้นอีกครั้งหรือสูงกว่าระดับก่อนหน้า แสดงว่ามีการกลายพันธุ์ของไวรัส

4. การทดสอบเนื้องอก: แม้ว่ากลไกการพัฒนาเนื้องอกยังไม่ชัดเจน แต่เป็นที่ยอมรับกันโดยทั่วไปว่าการกลายพันธุ์ในยีนที่เกี่ยวข้องเป็นสาเหตุสำคัญของการเปลี่ยนแปลงของเนื้องอกการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นและการกลายพันธุ์ของเนื้องอกสามารถเห็นได้ในระยะแรกของเนื้องอกหลายชนิดPCR เชิงปริมาณการเรืองแสงแบบเรียลไทม์ไม่เพียงแต่มีประสิทธิภาพในการตรวจหาการกลายพันธุ์ในยีนเท่านั้น แต่ยังสามารถตรวจจับการแสดงออกของเนื้องอกได้อย่างแม่นยำอีกด้วยวิธีนี้ใช้เพื่อตรวจหาการแสดงออกของยีนต่างๆ รวมถึงยีน telomerase hTERT, ยีน WT1 มะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเม็ดละเอียดเรื้อรัง, ยีน ER ที่ทำให้เกิดมะเร็ง, ยีน PSM ของมะเร็งต่อมลูกหมาก และยีนไวรัสที่เกี่ยวข้องกับเนื้องอก

แปลด้วย www.DeepL.com/Translator (เวอร์ชันฟรี)


เวลาโพสต์: 21 มิถุนายน-2022